채진목(Amelanchier asiatica) 에탄올 추출물의 생리활성

채정우1, 조영제*3, 조분성2, 천성숙3, 김경환1

1경기도산림환경연구소, 2경북대학교 식품공학과, *3경북대학교 식품공학부

Biological Activity of Ethanol Extracts from Amelanchier asiatica

Jung-Woo  Chae1,  and Young-Je Cho*3, Jin-Sung Kim2, Sung-Sook Chun3, Kyung-Hwan Kim1

1Gyeonggi-do Forest Environment Research Institute, Osan 447-290, Korea

2Department of Food Engineering, Kyungpook National University, Sangju 742-711, Korea

*3School of Food Science & Biotechnology, Food &Bio-Industry Research Institute, Kyungpook National University, Daegu 702-701, Republic of Korea

Amelanchier asiatica have been used as a traditional medical food. The research was investigated to assess Antioxidants, Angiotensin converting enzyme(ACE), Xanthine oxidase, and Elastase inhibition effects. The content of total phenolic compounds in Amelanchier asiatica Extracts was 17.6mg/ml. In extracts, the EDA by DPPH free radical scavenging test of Amelanchier asiatica was 90.18% at 200 μg/ml. The ABTS radical decolorization of Amelanchier asiatica Extracts was 98.81% at 200 μg/ml. The inhibition rate of the antioxidant protection factor was 1.03 PF, and TBARS was 73.27%  at 200 μg/ml. The xanthine oxidase inhibition activity of Amelanchier asiatica Extracts of showed to be 13.19% at 200ug/ml. The angiotensin converting enzyme (ACE) activity was significantly inhibited by Amelanchier asiatica Extracts. (82.52% inhibition at 200 ug/ml) Elastase inhibition activity in the Amelanchier asiatica Extracts(41.48% at 200 ug/ml) was higher than Vit.C.(12.8% at 200 ug/ml)

This suggests that Amelanchier asiatica have the greatest property as a functional food source.

Key words  : Amelanchier asiatica, Xanthine oxidase, Angiotensin converting enzyme(ACE), Elastase, Antioxidants

서 론

빠른 산업화로 인하여 국민소득 또한 빠르게 향상 되었고, 우리의 삶은 넉넉하고 윤택하여 졌지만, 이러한 이면 뒤에는 환경오염과 업무의 과중, 스트레스 등의 커다란 사회문제로 대두되고 있다. 이러한 환경적 요인들로 인하여 현대인들은 비만, 고혈압 등의 각종 성인병에 노출되어있고, 이러한 문제들을 개선하기 위해 많은 연구가 진행되고 있는 실정이며, 특히 이러한 성인병들은 식습관과 관련된 환경요인에 깊은 연관성이 있다고 알려지면서, 식습관의 중요성이 크게 대두되고 있으며, 이러한 웰빙문화로 인하여 건강기능성 식품과 보조식품의 수요 또한 증가하게 되었다.[1,2]

기능성 식품에 대한 수요의 증가는 항산화 활성물질과 생리활성물질의 관심으로 이어지고 있으며. 이는 소비자들에게 식품의 안전성에 대한 관심도를 유발하여 인위적인 합성물이 아닌 천연물이나 천연물유래의 생리활성물질에 대한 필요성을 야기하였다.

최근에는 많은 천연소재의 생리활성물질의 연구가 활발히 진행되고 있는 상황이다.

또한 이러한 연구는 건강식품의 항산화 활성과 현대인들이 많은 관심을 가지고 있는 피부노화에 대한 Anti-aging 등의 다양한 기능에 초점이 맞추어져있다. 따라서 기존의 천연물보다 좋은 기능성과 안전성이 요구되는 새로운 천연소재의 개발이 절실히 요구되는 실정이다.[3]

독요나무라고 불러지는 채진목(Amelanchier asiatica)은 낙엽활엽관목으로 원산지는 한국이며, 한국, 중국, 일본에 널리 분포하며 전국에서 생육이 가능한 나무이다. 수고는 10m이고 수피는 회색을 띤 갈색으로 매끄러우며 세로로 얕게 갈라지며 벗겨지지는 않는다. 어린가지는 껍질눈이 많다. 잎은 어긋나며 끝이 뾰족한 달걀모양 또는 긴 타원모양으로 가장자리에 잔거치가 있다. 잎의 양면에는 솜털이 있다 점점 없어지고 잎자루에 흰색의 털이 있지만 없어지는 것이 많다. 꽃은 양성화로 4~5월에 피며 흰색의 산방상 총상화서로 달리며 꽃받침은 바소 모양으로 젖혀지며 꽃잎은 선모양으로 길고 각각 5장이다. 수술은 20개이고 암술대는 5개이다. 열매는 이과로 9~11월에 흑자색으로 익으며 둥근모양이고 꽃받침자국이 남아있는 것이 특징이다(Fig. 1). 전통적인 우리의 한의학에서는 국내에서 자생하고 쉽게 얻을 수 있는 식물들을 한약의 재료로 사용하여 왔다. 채진목의 경우도 널리 이용되어 지고 있지는 않지만, 동물들이 그 열매를 이용하는 것으로 보아 충분한 이용가능성을 비치고 있다.

Fig. 1.  채진목(Amelanchier asiatica) 열매 사진

재료 및 방법

실험재료

경기도산림환경연구소 내 전시포지에서 채취한 채진목 (Amelanchier asiatica)를 공시재료로 사용하여, 원재료에 70% 에탄올을 시료 중량의 10배 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상층액과 침전물을 분리한 후 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 추출물을 여과, 농축 및 동결건조 후 -80℃ deep freezer에 보관하여 본 실험의 시료로 사용하였다.

폴리페놀함량측정

총 페놀 화합물은 Folin-Denis 방법[4]으로 측정하였으며, 시료 1 mL에 95% ethanol 1 mL와 증류수 5 mL를 첨가하고 1N Folin-ciocalteu reagent 0.5 mL를 넣어 잘 섞어주고, 5분간 방치한 후, Na2CO3 1 mL를 가한 후, 흡광도 725 nm에서 1시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.

전자공여능 측정(DPPH)

DPPH radical에 대한 소거활성은 Blois의 방법[5]을 변형하여 측정하였다. 각 시료 0.5 mL에 60 μM DPPH 3 mL를 넣고 vortex한 후 15분 동안 방치한 다음 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 다음 식으로 나타내었다.

전자공여능 (%) = (1-	반응구의 흡광도	) × 100
	대조구의 흡광도

ABTS radical cation decolorization 측정

ABTS radical cation decolorization의 측정은 Pellegrin등의 방법[6]에 의해 측정하였다. 즉, 7 mM ABTS와 140 mM K2S2O8을 5 mL : 88 μL로 섞어 어두운 곳에 14~16시간 방치시킨 후, 이를 absolute ethanol과 1:88비율로 섞어 734 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7± 0.002가 되도록 조절한 ABTS solution을 사용하였다. 시료용액 50 μL와 ABTS solution 1 mL를 30초 동안 섞은 후 2.5분간 incubation하여 734 nm에서 흡광도를 측정하여 아래의 식에 의해 저해율을 계산하였다.

저해율 (%) = (1 -	반응구의 흡광도	) × 100
	대조구의 흡광도

Thiobarbituric acid reaction substance(TBARs) 측정

TBARS는 Burge와 Aust의 방법[8]에 따라 측정하였다. 1% linoleic acid와 1% Tween 40으로 emulsion을 만들고 emulsion 0.8 mL와 시료 0.2 mL를 섞은 후 50℃ water bath에서 10시간 반응시켰다. 반응 후 반응액 1 mL에 TBA regent 2 mL를 가하고 15분간 boiling한 다음 10분간 냉각시킨 후 15분간 1000 rpm(vision, VS-5500N)으로 원심분리하여 실온에서 10분간 방치 후 상등액을 532 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, TBARS값은 흡광도 수치 × 0.0154로 1 mL 반응혼합물에 대해서 생성된 1,1,3,3-tetraethoxy propane(TEP)의 μM으로 표시하였다.

저해율 (%) = (1-	반응구의 TBARs μM	) × 100
	대조구의 TBARs μM

Antioxidant protection factor 측정

PF는 Andarwulan과 Shetty의 방법[7]으로 측정하였다. 10 mg의 β-carotene을 50 mL 의 chloroform에 녹인 용액 1 mL를 evaporator용 수기에 넣고 40℃ water bath에서 chloroform을 증류시킨 후 20 μL linoleic acid, 184 μL Tween 40과 50 mL H2O2를 가하여 emulsion을 만들고, 5 mL의 emulsion에 시료용액 100 μL를 혼합하여 vortex로 잘 섞어준 뒤 50℃에서 30분간 반응 시켜 냉각시킨 다음, 470 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

PF =	반응구의 흡광도
	대조구의 흡광도

Angiotensin converting enzyme(ACE) 저해효과 측정

Angiotensin converting enzyme(ACE) 저해효과 측정은 Cushman 등의 방법[9]으로 행하였다. 즉, 반응구는 0.3 M NaCl을 함유하는 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 8.3)에 기질인 HHL 2.5 mM을 녹인 액 0.15 mL, ACE(0.25 unit/mL, Sigma사) 0.1 mL와 각 추출시료 용액 0.1 mL를 혼합하였으며, 대조구는 추출시료 대신 증류수 0.1 mL를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시키고, 1 N HCl 0.25 mL 첨가로 반응을 중지시킨 뒤 3 mL의 ethylacetate를 첨가하였다. ethylacetate 층으로부터 용매를 휘발시킨 후 잔사에 증류수 2 mL를 첨가하여 추출된 hippuric acid를 spectrophotometer를 사용하여 흡광도 280 nm에서 측정한 후 다음 식에 따라 저해율(%)을 구하였다.

저해율 (%) = (1-	반응구의 hippuric acid의 생성량	) × 100
	대조구의 hippuric acid의 생성량

Xanthine oxidase(XOase) 활성저해 측정

Xanthine oxidase(XOase) 활성저해 측정법은 Stirpe와 Corte 의 방법[10]에 준하여 측정하였다. 즉, 반응구는 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.5)에 xanthine 2 mM을 녹인 기질액 3 mL에 효소액 0.1 mL와 추출용액 0.3 mL를 넣고 대조구에는 추출용액 대신 증류수를 0.3 mL 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시키고 20% trichloroacetic acid(TCA) 1mL를 가하여 반응을 종료시킨 다음 원심분리하여 단백질을 제거한 후 반응액 중에 생성된 uric acid를 흡광도 292 nm에서 측정하여 다음 식으로 저해율을 구하였다.

저해율 (%) = (1-	반응구의 uric acid의 생성량	) × 100
	대조구의 uric acid의 생성량

Elastase 저해활성 측정

Elastase 저해활성 측정은 Cannell 등의 방법[11]에 따라 측정하였다. 기질로서 N-succinyl- (L-Ala)3-p-nitroanilide를 사용하여 37℃에서 20분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 445 nm에서 측정하였다. 즉, 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5 mL씩 시험관에 취하고, 50 mM tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase(2.5 U/mL)용액 0.5 mL을 가한 후 기질로 50 mM tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)3- p-nitroanilide(0.5 mg/mL)을 첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다. Elastase 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

저해율(%) = ( 1 -	시료첨가군의 흡광도	) ×100
	무첨가군의 흡광도

결과 및 고찰

폴리페놀함량 측정

식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물인 페놀성화합물은 분자 내 phenolic hydroxyl기가 효소 단백질과 같은 거대 분자들과 결합하여 생리활성 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다. 항산화 활성과 관련되어 생체 내 산소 free radical 반응이 생체조직의 노화나 질병에 영향을 미치며, 다양한 페놀성 물질들은 이러한 free radical소거능이 우수하다고 보고되고 있다[12].

시료로부터 유용성분을 추출하기 위하여 페놀성 물질의 함량을 측정한 결과 Table1과 같이 17.6±0.61mg/g 으로 Yoo 등이[13] 보고한 솔잎 수용성 추출물의 함량인 16.1mg/g 보다 1.5mg/g이 많은 함량이다.

Table1. Total polyphenol content of Amelanchier asiatica extracts

Sample	Phenol content(mg/g)
Amelanchier asiatica	17.6±0.61

전자공여능 측정(DPPH)

지질과산화의 연쇄반응에 관여하여 산화성의 Free-Radical의 전자를 공여하여 산화를 억제시키는 DPPH 전자공여능을 50~200μg/ml농도로 채진목을 첨가하여 측정한 결과 Table 2와 같이 50μg/ml의 함량에서 60%에 가까운 전자공여능을 나타냈으며, 200μg/ml이상의 함량에서는 90%이상의 우수한 효과를 나타내었다. 이는 Lee등이[14] 보고한 만형자 추출물의 농도별 전자공여능에서 500μg/ml의 함량에서 90%이상 효과를 보인 것보다 우수한 결과이다.

ABTS radical cation decolorization 측정

potassium per sulfate와의 반응에 의해 생성된 ABTS+ free radical이 50~200μg/ml 다양한 농도의 채진목 추출물의 항산화 물질에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색된다[6]. 이러한 기능을 이용하여 항산화 활성을 측정한 결과 Table 2와 같이 50μg/ml에서 65%이상의 활성을 보였으며, 200μg/ml에서 98%의 매우 우수한 결과를 나타내었다.

Thiobarbituric acid reaction substance(TBARs) 측정

다양한 농도의 채진목 추출물의  thiobarbituric acid reactive substance를 측정한 결과[8] 150μg/ml의 함량에서 51%이상의 효과를 나타내었으며, 200μg/ml이상의 함량에서는 73%이상의 우수한 항산화 효과를 나타내었으며, 이는 50~200μg/ml의 함량이 순차적으로 증가함에 따라 항산화 효과도 증가함을 알 수 있었다.

Antioxidant protection factor 측정

지질 산화과정에서 생성되는 peroxy radical과 반응하여 불활성물 (inactive products)을 형성하고 그로 인해 free radical에 의한 연쇄 반응을 중단시킨다는 β-carotene은 주로 lipoprotein과 같은 지방친화성 구조의 내부에 존재하면서 singlet oxygen을 효과적으로 억제하는 것으로 알려져 있다[7].

Table 2 와 같이 PF의 값이 200μg/ml에서 1.03을 나타내어 지용성물질에 대한 항산화력이 강하지는 않지만 존재함을 알 수 있었다.

Table 2. Electron donating ability of various extracts from Amelanchier asiatica

Antioxidant assay	Phenol content (μg/ml)
	Antioxidant activity (%)
	50	100	150	200
DPPH (%)	59.31±2.17	71.58±1.25	84.15±2.57	90.18±4.06
ABTS (%)	65.08±1.07	71.25±2.04	87.24±1.52	98.81±0.71
TBARS (%)	20.12±1.25	37.98±3.35	51.27±3.19	73.27±5.15
PF (%)	ND	ND	0.82±1.25	1.03±0.30

ND : not detected

ACE 저해활성 측정

ACE는 renin에 의해 생성된 AngiotensinⅠ의 C-말단부터 가수분해하여 AngiotensinⅡ 전환시키는 효소로  AngiotensinⅡ는 강력한 혈관수축 작용으로 혈압을 상승시켜 고혈압의 주된 원인이 되며,[15] 이러한 ACE 활성의 저해요소로는 메밀에 많이 포함된 Rutin과 저분자 pep-tide, 그리고 녹차에 함유되어있는 catechin등 Polyphenol성분이 대표적이다. 이러한 ACE의 작용을 억제하기 위하여 농도별 채진목 추출물의 Angiotensin converting enzyme(ACE) 저해효과를 측정한 결과 Table 3과 같이 대조구에서 11.48ug/ml의 Hippuric acid를 생성한 것에 대하여 채진목 추출물 150ug/ml에서 50%이상의 저해력을 가졌으며, 200ug/ml에서는 82%이상의 우수한 저해력을 가졌다. 이는 Cho 등이[16] 보고한 복분자 추출물의 78.0%의 저해력보다 4%이상 뛰어난 수치이다.

Table 3 .Angiotensin converting enzym (ACE) inhibition of various extracts from Amelanchier asiatica

Phenol conrent(ug/ml)	EtOH extracts
	Hippuric acid (ug/ml)	lnhibition activity(%)
control	11.48±0.55	0
50	9.67±2.49	25.53±1.68
100	8.25±2.79	39.40±2.63
150	6.94±1.45	50.75±2.48
200	2.53±1.05	82.52±3.60

Xanthin oxidase저해활성 측정

생채 내에서 Purine 대사에 관여하는 Xanthin oxidase는 hypoxanthine과 xanthine으로부터 uric acid를 생성시켜 혈장 내 침착되어 통풍과 신장질환의 원인이 된다.

이러한 Xanthin oxidase의 작용을 억제하기 위하여 각 농도별 채진목 추출물의 저해활성을 측정한 결과 Table 4와 같이 50ug/ml에서 1.71%의 미미한 저해효과를 보였으나, 농도가 상승함에 따라 100, 150ug/ml의 함량에서 각각 4.70, 8.21%의 저해율을 보였으며, 특히 200ug/ml에서 13.19%의 저해율로 대조구인 Vit.C 200ug/ml의 함량에서의 경우와 비슷한 저해율을 보였다. 이는 An 등이 보고한[17] 산사자 물, 에탄올추출물 1000ug/ml의 농도에서 11%의 저해율을 나타낸 것에 비하면 5배이상의 좋은 저해율을 나타낸 것이다.

Table 4 . Xanthin oxidase inhibition of various extracts from Amelanchier asiatica

Phenol conrent(ug/ml)	EtOH extracts
	Uric acid (ug/ml)	lnhibition activity(%)
control	22.45±1.59	0
Vit.C (200ug/ml)	19.54±0.85	13.11±1.01
50	22.07±1.25	1.71±0.85
100	21.41±0.45	4.70±0.85
150	20.62±2.15	8.21±0.49
200	17.09±2.04	13.19±1.03

Elastase 저해활성 측정

피부조직의 기능적, 구조적인 변화로 일어나는 피부노화(skin aging)는 외인성과 내인성 요인에 의하여 피부에 주름이 생기는 것을 말한다[18,19,20]. 주름은 진피층에 속에 있는 extracellular matrix의 구조적인 변화로 발생이 되는데[21,22,23], 그 요소중 Collagen양의 감소와 Elastic fiber의 변성이 주름을 생성시킨다[24].

피부 진피층의 기질 단백질인 Elastin은 피부의 탄력을 유지시켜주는 기능을 한다[25].이러한 Elastin과 collagen을 분해하는 비특이적 가수분해 효소인 Elastase의 활성으로 인하여 피부의 노화가 진행되어 주름이 발생하게 되는데, 이러한 Elastase의 저해시킴으로서 주름개선효과를 볼 수 있다.

Elastase의 저해활성을 측정한 결과 Fig 1과 같이 채진목 추출물의 농도가 진해짐에 따라서 Elastase의 저해활성이 높아짐을 알 수있다. 특히 50ug/ml에서는 대조구인 Vit.C의 와 채진목 추출물 모두 비슷한 0.71,3.43%의 아주 낮은 저해율을 나타내다, 일정량인 150ug/ml이상의 함량을 첨가하자 채진목의 경우 20%이상의 우수한 저해를 나타내었으며, 200ug/ml 의 농도로 첨가 시 Vit.C는 12%이상, 채진목은 40%이상의 월등한 저해효과를 나타내었다. 이는 Cho 등이[26] 발표한 감태의 Elastase의 저해활성 경우 500ug/ml에서 38%의 저해율을 보인데 비해 2배이상의 효과를 나타낸 것이다.

Fig 1. Elastase inhibition of inhibition of various extracts from Amelanchier asiatica.

초  록

본 연구에서는 낙엽활엽관목인 채진목(Amelanchier asiatica)의 페놀성 물질을 다양한 농도로 농축하여 항산화 활성과 Xanthine oxidase, Angiotensin converting enzyme(ACE) 그리고 Elastase 저해활성 등의 생리활성 효과를 조사해 보았다. 채진목은 17.6mg/g의 페놀성 물질을 함유을 가지고 있으며, 이를 50~200ug/ml의 여러 농도로 실험한 결과 항산화 활성 실험에서 전자공여능(DPPH)은 50ug/ml 이상으로 처리했을 때, 50%이상의 효과를 보였으며, 200ug/ml이상 처리 하였을때는 90%이상의 전자공여능을 보였다. 또한 ABTS radical cation decolorization 측정과 Thiobarbituric acid reaction substance(TBARs) 측정에서도 각각 200ug/ml이상 처리하였을 때, 98%와 73%의 우수한 항산화력을 보였으며, Antioxidant protection factor 측정에서는 1.03PF의 효과를 보였다. Xanthin oxidase 저해활성 측정에서는 200ug/ml이상 처리하였을 때, 대조구인 Vit. C와 같이 13%이상의 저해활성을 나타냈으며, ACE 저해 활성에서는 150ug/ml에 50%이상 200ug/ml에서는 82%이상의 우수한 저해활성을 확인할 수 있었다. 마지막으로 Elastase 저해활성에서는 50, 100, 150, 200ug/ml 첨가 시 각각 3.4, 18.36, 31.77, 41.28%의 저해율을 보여 농도가 증가함에 따라 그 효과 또한 증가함을 알 수 있었다. 또한 대조구인 Vit.C가 200ug/ml 첨가 시 12.8%의 낮은 저해율을 보여 상대적으로 그 효과의 우수함을 알 수 있었다.  본 연구의 결과는 앞으로 채진목의 항산화 활성 및 통풍과 고혈압, 주름개선에 도움을 줄 수 있는 기능성 식품 및 화장품의 개발의 가능성을 보이며, 안전한 천연 소재로서의 채진목의 가치가 기대 할 수 있게 하였다.

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